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常见问题

多重qPCR探针的荧光基团的要求

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2020-07-08

    常规的qPCR,在一个反应管中仅检测单一指标,如果检测的指标很多或者检测的样本很多,对qPCR试剂以及样本无疑是一种巨大的浪费。在多重qPCR中,单反应管扩增检测多个靶标。每一个靶标都被一套不同(或相同)的引物扩增,并且一个特异的探针区分每一个PCR扩增。因此,你可以快速测量几个靶标或目的基因的表达水平。这种多个指标在单个反应管中同时完成检测的方法极大地减少了相关试剂的用量,即使拥有足够的qPCR酶,多重qPCR也会节省您的样本处理时间及其他试剂耗材。

    多重qPCR的要求——以探针法为主

    由于多个指标是在一管内完成检测,要区分这几个指标的信号,就无法使用常规的SYBR Green I染料来标记扩增产物。水解探针法是最常用的解决方案,即针对每一个指标,设计特异性的探针,利用不同探针上标记的不同波长的荧光基团来区分每个指标的荧光变化。

    多重qPCR探针的荧光基团的要求

    1. 避免荧光基团相互干扰

    多重qPCR的实验设计要求比单一反应体系的要复杂的多。检测不同指标的探针必须携带不同光谱范围的荧光基团。下图是几种常用的荧光基团的发射光谱(图片来自于IDT),由图中可见,很多荧光光谱相近的荧光基团,它们虽然最大发射波长不同,但是在附近的波段内还是会有相互重叠的,一定要避免荧光基团发射光谱之间的相互干扰。
    多重qPCR

    2. 根据荧光强度分配检测指标

    不同荧光基团的荧光强度是有高有低的,例如FAM就是一个荧光强度相对较高的基团,我们偏向于将其安排给相对表达量比较低的目的基因,而荧光强度相对较低的基团可以用于检测表达量比较高的如看家基因等,这样会达到扩增曲线平台期接近的目的,结果会比较美观。

    3. 按照荧光定量PCR仪来选择荧光基团

    不同荧光定量PCR仪的激发光和发射光都是不相同的,因此需要根据对应的仪器选择适配的荧光基团。目前最广泛通用的荧光基团为FAM(FITC),因此,绝大多数多重qPCR策略首选的一个通道为FAM。如果使用仪器不适配的荧光基团,则在此之前必须对仪器针对这种荧光基团进行矫正。目前,主流的荧光定量PCR仪还是能够支持较多通道的多重检测的,小编根据IDT的数据进行了整理,贡献出下表供您选择:

    4. 搭配淬灭基团的选择

    在选完探针的荧光基团之后,根据荧光基团的种类搭配淬灭基团即可,多重qPCR并不要求淬灭基团的不同,例如两重qPCR分别选择了FAM及VIC作为荧光基团,淬灭基团可以统一选择BHQ-1。

    多重qPCR还需要优化引物探针序列的特异性,防止其相互产生干扰;确定最佳的引物-探针比值等等工作。正常情况极限不超过4重,超过4重的会比较困难。

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