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常见问题

PCR仪操作常见问题与维护指南

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2020-06-30

    今天来给大家整理下pcr实验操作注意事项及常见问题、维护指南。简单的说,PCR就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内In Vitro的大量合成,基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制。

    目前,常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。根据DNA扩增的目的和检测的标准,可以将PCR仪分为普通PCR仪,梯度PCR仪,原位PCR仪,实时荧光定量PCR仪四类。
    pcr仪

    pcr实验操作注意事项:

    尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因,样品间的交叉污染也是原因之一。因此,不仅要在进行扩增反应是谨慎认真,在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意:

    1.戴一次性手套,若不小心溅上反应液,立即更换手套;

    2.使用一次性吸头,严禁与PCR产物分析室的吸头混用,吸头不要长时间暴露于空气中,避免气溶胶的污染;

    3.避免反应液飞溅,打开反应管时为避免此种情况,开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上,应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面;

    4.操作多份样品时,制备反应混合液,先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后分装,这样即可以减少操作,避免污染,又可以增加反应的精确度;

    5.最后加入反应模板,加入后盖紧反应管;

    6.操作时设立阴阳性对照和空白对照,即可验证PCR反应的可靠性,又可以协助判断扩增系统的可信性;

    7.尽可能用可替换或可高压处理的加样器,由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染,最好使用可替换或高压处理的加样器。

    如没有这种特殊的加样器,至少PCR操作过程中加样器应该专用,不能交叉使用,尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区;

    8.重复实验,验证结果,慎下结论。

    PCR主板,控制整个机器运行

    具体归类为以下常见的4点,描述如下:

    问题一:无扩增产物

    现象:正对照有条带,而样品则无

    原因:

    1、模板:含有抑制物,含量低

    2、Buffer对样品不合适

    3、引物设计不当或者发生降解

    4、反应条件:退火温度太高,延伸时间太短

    对策:

    1、纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量

    2、更换Buffer或调整浓度

    3、重新设计引物(避免链间二聚体和链内二级结构)或者换一管新引物

    4、降低退火温度、延长延伸时间

    问题二:非特异性扩增

    现象:条带与预计的大小不一致或者非 特异性扩增带

    原因:

    1、引物特异性差

    2、模板或引物浓度过高

    3、酶量过多

    4、Mg2+浓度偏高

    5、退火温度偏低

    6、循环次数过多

    对策:

    1、重新设计引物或者使用巢式PCR

    2、适当降低模板或引物浓度

    3、适当减少酶量

    4、降低镁离子浓度

    5、适当提高退火温度或使用二阶段温度法

    6、减少循环次数

    问题三:拖尾

    现象:产物在凝胶上呈Smear状态

    原因:

    1、模板不纯

    2、Buffer不合适

    3、退火温度偏低

    4、酶量过多

    5、dNTP、Mg 2+浓度偏高

    1、纯化模板

    2、更换Buffer

    3、适当提高退火温度

    4、适量用酶

    5、适当降低dNTP和镁离子的浓度

    6、减少循环次数

    问题四:假阳性

    现象:空白对照出现目的扩增产物

    原因:

    靶序列或扩增产物的交叉污染

    对策:

    1、操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外;

    2、除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。

    3、各种试剂最好先进行分装,然后低温贮存

    pcr仪器的维护保养

    需要注意以下问题:

    实验室使用的基因扩增仪,荧光定量PCR仪都是高精度仪器。一旦仪器出现一些温度或者检测上的小偏差,则很可能对实验结果产生较大的影响。因此,学会日常保养和维护是尤为重要的。

    1、仪器安置

    仪器应安放在湿度较低、灰尘较少并远离水源和热源的地方,无腐蚀性气体或强磁场干扰。

    环境温度建议在18——35℃之间。仪器之间应保持50cm 以上距离,降低仪器之间的影响。

    2、样品台、热盖定期清洁

    用95%乙醇配合棉签、无尘布等工具,清洁样品台。之后运行PCR仪,设定保持温度为50℃,约5——10min,让残余液体挥发去除。

    另外,热盖也应该用酒精或纯水定期清洗,确保热盖清洁,温控性能良好。对于荧光定量PCR,清洁样品台和热盖的同时,去除灰尘等杂物,保证光路清洁,降低信号干扰。

    3. 使用前预热

    老款的PCR仪的性能比不上新款仪器,使用前需要进行预热,不仅对仪器维护有好处,还能节约实验时间。新款的仪器升温快,但还是建议最好能在进行实验前预热2min,这样可以有效延长仪器的使用寿命。

    4. 定期运行维护

    1.PCR仪维护保养需要定期检测,视制冷方式而定一般半年至少一次。

    2.PCR反应的要求温度与实际分布的反应温度是不一致的,当检测发现各孔平均温度差偏离设置温度大于1——2℃时,可以运用温度修正法纠正PCR实际反应温度差。

    3.PCR反应过程的关键是升、降温过程的时间控制,要求越短越好,当PCR仪的降温过程超过60s,就应该检查仪器的制冷系统,对风冷制冷的PCR仪要较彻底地清理反应底座的灰尘;对其他制冷系统应检查相关的制冷部件。

    4.一般情况如能采用温度修正法纠正仪器的温度时,不要轻易打开或调整仪器的电子控制部件,必要时要请专业人员修理或利用仪器电子线路详细图纸进行维修。

    pcr其他注意事项

    另外,由于生产厂家和仪器型号的不同,仪器在保养上也会有差异,有些荧光定量PCR仪,采用底部检测的模式,平时使用仪器附件中的橡胶风球吹去样品台上的灰尘等。必要的时候,可以用棉签沾取无水酒精清洁,但需要注意不要把液体滴入检测孔中,防止影响里面的光路部件。

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