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常见问题

PCR仪的使用经验,附保养注意事项

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2020-06-02

    简单的说,PCR就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内In Vitro的大量合成,基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制。目前,常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。根据DNA扩增的目的和检测的标准,可以将PCR仪分为普通PCR仪,梯度PCR仪,原位PCR仪,实时荧光定量PCR仪四类。

    PCR产物的电泳检测时间

    一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚至消失。

    PCR反应的关键环节

    ①板核酸的制备

    ②引物的质量与特异性

    ③酶的质量

    ④PCR循环条件,寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究

    酶切分析

    根据PCR产物中限制性内切酶的位点,用相应的酶切、电泳分离后,获得符合理论的片段,此法既能进行产物的鉴定,又能对靶基因分型,还能进行变异性研究。

    分子杂交

    分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据,也是检测PCR产物碱基突变的有效方法。

    Southern印迹杂交

    在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针,与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定,又可以提高检测PCR产物的灵敏度,还可知其分子量及条带形状,主要用于科研。

    斑点杂交

    将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上,再用内部寡核苷酸探针杂交,观察有无着色斑点,主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。

    氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。

    一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增。

    RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止R-Nase降解RNA。

    温度与时间的设置

    基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。

    在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90——95℃变性,再迅速冷却至40——60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70——75℃,在Taq DNA聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸。

    对于较短靶基因(长度为100——300bp时)可采用二温度点法,除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。

    实验操作注意事项:

    尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因,样品间的交叉污染也是原因之一。因此,不仅要在进行扩增反应是谨慎认真,在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意:

    1.戴一次性手套,若不小心溅上反应液,立即更换手套;

    2.使用一次性吸头,严禁与PCR产物分析室的吸头混用,吸头不要长时间暴露于空气中,避免气溶胶的污染;

    3.避免反应液飞溅,打开反应管时为避免此种情况,开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上,应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面;

    4.操作多份样品时,制备反应混合液,先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后分装,这样即可以减少操作,避免污染,又可以增加反应的精确度;

    5.最后加入反应模板,加入后盖紧反应管;

    6.操作时设立阴阳性对照和空白对照,即可验证PCR反应的可靠性,又可以协助判断扩增系统的可信性;

    7.尽可能用可替换或可高压处理的加样器,由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染,最好使用可替换或高压处理的加样器。

    如没有这种特殊的加样器,至少PCR操作过程中加样器应该专用,不能交叉使用,尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区;

    8.重复实验,验证结果,慎下结论。

    在仪器的维护保养中,需要注意以下问题:

    1.PCR仪器需要定期检测,视制冷方式而定一般半年至少一次。

    2.PCR反应的要求温度与实际分布的反应温度是不一致的,当检测发现各孔平均温度差偏离设置温度大于1——2℃时,可以运用温度修正法纠正PCR实际反应温度差。

    3.PCR反应过程的关键是升、降温过程的时间控制,要求越短越好,当PCR仪的降温过程超过60s,就应该检查仪器的制冷系统,对风冷制冷的PCR仪要较彻底地清理反应底座的灰尘;对其他制冷系统应检查相关的制冷部件。

    4.一般情况如能采用温度修正法纠正仪器的温度时,不要轻易打开或调整仪器的电子控制部件,必要时要请专业人员修理或利用仪器电子线路详细图纸进行维修。

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