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常见问题

PCR测序技术的方法与应用

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2020-05-29

    自从 Sanger等(1975)引人双脱氧核苷三磷酸( ddNTP)作为链终止剂,DNA序列测定技术得到迅速发展。 ddNTP在DNA聚合酶作用下,通过其5三磷酸基团可以掺入到正在延伸的DNA链中,但由于其脱氧核糖3位置缺少一个羟基,因此不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键,使得DNA链的延伸被终止。根据此原理,在DNA合成反应混合物的4种dNTP中加入一定比例的一种 ddNTP,dNTP参与的链延伸将与ddTP参与的链终止发生随机竞争,最终反应产物是一系列的寡核苷酸链,其长度取决于从用以起始DNA合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离。在4组独立的酶反应中分别采用4种不同的dNTP,结果将产生4组寡核苷酸链,它们将分别终止于模板链的每个A、C、G或T的位置上,通过电泳分离和放射自显影,就可以进行序列判读。
    PCR测序根据标记的方式不同和循环的次数不同可分为直接测序法和循环测序法。

    直接测序法

    一、原理
    PCR扩增获得双链DNA产物经变性形成单链,测序引物与其中一条模板链上的互补序列退火。退火的引物在低进行性反应条件下(如低温和低dNTP浓度),通过DNA聚合酶催化作用延伸20——80个核苷酸;由于此反应体系中掺入放射性标记的dNTP,能使新合成的DNA链中含有多个放射性标记,便于产生高放射显影度。标记的DNA链在高进行性反应条件下,通过DNA聚合酶催化进行延伸,通过在反应体系中掺入 ddNTP,使链延伸反应终止。反应产物经过电泳分离和放射自显影,就可以进行序列判读。
    二、材料
    (1)DNA模板PCR产物离子交换色谱纯化,作为DNA模板,浓度为:0.01——0.1mmol/L。
    (2)引物20个核苷酸的DNA引物可以不经过纯化,直接用作测序引物,引物浓度 l mmol/L
    (3)DNA聚合酶要求该酶在低温条件下仍具有活性,以便有效地在新合成的DNA链中掺入放射性标记。比如USB/ Amersham公司生产的测序酶2.0。
    (4)测序反应缓冲液根据测序酶具体而定,如测序酶2.0的反应缓冲液可用40mmol/LTris-HCl(pH7. 5), 20mmol/L MgCI, Fl 50mmol/L NaCl.
    (5)放射性标记的dNTP一般为[aP]dATP、[a3P]dATP或[a3S]dATP。
    三、方法
    (1)制备链延伸终止反应混合物分别在4个微量离心管中各加入一种 dNTP/ddNTP的混合物2.5,其中dNTP和dNTP浓度分别为80m0/L和8pmol/L,37℃预热5mine
    (2)制备退火混合物在一个微量离心管中加入PCR扩增DNA1pmol,测序引物1012p5×测序反应缓冲液,用水调整至总反应体积10pl
    在加热仪内94——96℃加热8min后,迅速放入冰浴中冷却lmin(适合于双链DNA模板),或者在加热仪内65℃加热6min后在加热仪内自然冷却到30℃(适合于单链DNA模板)。1000r/min离心10s后在冰浴中冷却,并迅速进行下一步操作。
    (3)标记反应在退火混合物中加入2l预冷的dNTP混合物(含dTTP、dGTP和dCTP各0.75mol/L,5C的[a2P]dATP),1plo.1mol/LDDT,现稀释的测序酶2U,并用水将反应体系调整到15.5,混匀后在冰上孵育2min,放射性标记新合成的DNA链。
    (4)链延伸终止反应将3.5标记混合物分别加入4管链延伸终止反应混合物中,37℃进行链延伸终止反应5min。
    (5)终止反应体系在各管中加入4终止液(95%甲酰胺,20mmo/ L EDTA,0.05%溴酚蓝,0.05%二甲苯腈蓝FF),终止反应。样品可以一70℃保存2——7d。电泳前在电热仪上80℃加热3min。
    (6)电泳分离和放射自显影每一泳道上样2——3μl,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。
    P标记的需要过夜曝光显影,若用P标记的需要2——3d曝光显影,读片。
    四、注意事项
    ①标记反应最为关键,应在低进行性反应条件下进行。退火后引物只被延伸20——80个核苷酸,并在新合成的DNA链中掺入多个放射性标记。对高GC碱基含量的DNA模板,可用[aP]dCTP代替[aP]dATP。
    ②对高GC碱基含量的DNA模板,链延伸终止反应混合物中应用7-脱氧2dGTP替代dGTP,以消除电泳过程由于压缩现象产生的假带。

    循环测序法

    一、原理
    循环测序法是利用热循环仪高效的自动循环能力,使链终止的序列产物以线性方式获得扩增,从而产生高显影度的序列梯度。首先将PCR扩增的DNA经变性形成单链形式,使标记引物(P、生物素或荧光标记)与其中的一条链上的互补序列退火。退火后的引物在耐热DNA聚合酶催化下发生链延伸终止反应。由此产生的模板链与延伸终止链形成的部分双链产物在下一轮测序循环中,再次被变性,释放出模板链,作为又一轮引发反应的模板,同时积累下每轮循环产生的链终止产物。这种循环步骤重复20——40次,使链终止产物以线性方式扩增。
    与直接测序法相比较,循环测序法有如下优点:所需的模板DNA量少;在高温下进行,可使DNA聚合酶催化的聚合反应能够通过模板二级结构的区域;多轮的变性步骤便于对质粒DNA、ADNA、黏粒DNA和PCR产物等双链DNA模板进行测定,不需要经过一个单独的变性步骤而直接进行测序。
    二、材料
    (1)模板可用PCR扩增好的DNA作模板,也可使用低浓度的dNTP(10——20mol/L)和引物(1mmol/L)来进行靶DNA的PCR扩增,然后直接用PCR产物作为模板。DNA模板浓度:0.01mmol/L
    质粒DNA模板用质粒纯化试剂盒提取。对于高拷贝数的质粒可以直接从菌落中获得测序。测序反应的质粒典型用量:50——200mol
    其它模板(M13、黏粒及ADNA)的制备为常规分子生物学手段。M3和ADNA作为模板用量:10——100mo黏粒DNA作为模板用量:50——200mol
    (2)测序引物同位素标记测序引物:用[yP]ATP或[γP]ATP和T4多聚核苷酸激酶对引物的5末端进行同位素标记。引物浓度:0.1——0.2mmol/L
    非同位素标记测序引物设计:用荧光标记4种双脱氧核苷酸,可以进行以荧光为基础的双脱氧测序反应。
    (3)DNA聚合酶应为无3→5外切活性的耐热DNA聚合酶。如 Taq dnA聚合酶。
    (4)测序反应缓冲液根据所用的聚合酶具体而定。
    (5)放射性标记的dNTP根据所用的聚合酶具体而定
    三、方法
    (本操作方法是以同位素标记为基础的测序)
    (1)标记引物取10——15pmol测序引物、50pCi的[ y-3P]ATP、5μ10×激酶缓冲液(商品厂家提供),加水至反应体系50,混匀后37℃预热5min
    加人1μ现稀释的T4多聚核苷酸激酶(10U),37℃孵育30min;再加入10U的T4多聚核苷酸激酶,37℃继续孵育30min。
    通过凝胶过滤柱除去未掺入的[yP]ATP
    标记好的引物可在-70℃保存2周以上。
    (2)制备dNTP/ ddNTP混合物在4个微量离心管中各加入一种dNTP/ ddNTP混合物2ul
    (3)制备反应混合物取相应的DNA模板、标记的测序引物1——2pmol、3pl的10×测序反应缓冲液、5U的 Taq dnA聚合酶,加水至总体积20l,混匀。在该混合物中加入某些试剂,如DMSO、 Triton X-100、吐温20或NP40等,彻底混合均匀,可以提高序列梯度的质量。
    (4)循环反应分别取反应混合物4团l加人4管dNTP/dNTP混合物中,然后置于9℃的热循环仪上进行循环反应。每次循环包括:94℃变性1min、40——60℃退火30s和72℃链延伸终止30s。循环次数:20——40次。
    (5)终止反应体系循环结束后,在各管中加入4pl终止液(95%甲酰胺,20mmol/LEDTA,0.05%溴酚蓝,0.05%二甲苯腈蓝FF),混匀。样品可在一70℃保存2——7d。电泳前在电热仪上80℃加热3min
    (6)电泳分离和序列判读每一泳道上样2——3pl,电泳。采用放射自显影方法进行序列判读标记的需要过夜曝光显影,若用P标记的需要2——3d曝光显影。
    四、注意事项
    ①在标记引物过程中,为获得高比活的标记引物,反应体系中引物、激酶及[YP]ATP要保持在一个最佳水平
    ②确定最佳dNTP/dNTP比例非常关键,应采用产生低本底、高显影度的序列梯度所需要的最佳dNTP/dNTP比例。
    ③为了提高靠近引物(1——100个碱基范围内)的序列梯度的自显影强度,可以向测序反应体系中加人Mn2,提高DNA聚合酶对掺入 ddTP的效率( Tabor等,1989)。而当为了提高远离引物(200——400个碱基范围内)的序列梯带的自显影强度,则需要提高链延伸终止反应混合液中dNTP的含量,具体依所用聚合酶而定。

    全自动DNA测序法

    随着科学技术的发展,DNA测序已从人工操作发展到用自动测序仪进行全自动测序,使得测序的准确度、样品序列判读长度和速度有了极大的提高。如今科研工作者只需准备好所需测序的样品,送至专业的测序公司用全自动DNA测序仪(如 Applied biosystems的377型全自动DNA测序仪)进行测序即可。本节简单介绍全自动DNA测序仪的特点,不对全自动测序仪的具体操作步骤和注意事项等做详细介绍。
    全自动测序仪一般由:电泳系统,激光检测装置,软件,计算机和打印机等几部分组成。
    全自动测序仪采用4种荧光染料标记核苷酸、在一个泳道测序的方法,有效地避免了因单一标记方法(如同位素标记)中4个泳道电泳时所造成的迁移率不同对测序准确度的影响。
    由于可以采用两种荧光标记方法(标记dNTP法和标记引物5端法)、多种DNA聚合酶和测序试剂盒,使得测序DNA模板种类大大增加,如单链DNA、双链DNA和PCR产物等。
    全自动测序仪可以采用激光激发,使得代表不同碱基信息的不同颜色荧光先经过光栅分光,经CCD摄像机同步成像,一次扫描可以检出多种荧光,使得测序速度高达200bp/h,一个样品一次可以测定700余个碱基。
    在电泳技术方面,简化了灌胶技术,采用精确控温,提高了测序的精确度
    应用多种软件,可以进行DNA片段大小和定量分析、遗传基因的组型分析、DNA亚克隆序列拼接、DNA和蛋白质序列比较等。
    全自动测序仪可以使得一次测序样品数量大大增加,多达96个样品,极大地提高了工作效率。现在国内有许多公司进行全自动测序,只需要将克隆的菌株交给公司,一般在3——5d后即可得到结果,测序的长度在每个反应500——800bp左右。

    PCR测序技术的应用

    PCR测序是对生物遗传信息的最终判定。随着各种基因组计划的开展,PCR测序工作在不断加强和完善,特别是全自动DNA测序仪的开发,为提前完成人类基因组计划奠定了基础。此外,在临床遗传病、传染性疾病和癌症的基因诊断、农业畜牧业的动植物育种、法医鉴定等领域上有广泛的应用前景。过去由于全自动DNA测序的仪器成本较高,手工的同位素标记的测序在国内曾经发挥过重要作用;但随着国内科研试验条件的改变,全自动DNA测序仪已在国内广泛应用于序列的测定,但全自动DNA测序仪广泛应用于突变的检测目前还受国内实验条件的限制。比如2019年底爆发的新冠状病毒疫情,新病毒测序就是用到了pcr技术。

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