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常见问题

荧光定量PCR仪的操作流程与结果分析方法

作者:迪奈生物   发布时间:2020-04-25

    荧光定量PCR仪的操作流程:确立实验方案,样品制备,设计引物及探针,预实验,标准品及标准曲线的建立,定量PCR检测,分析数据。

    1、样品的制备

    DNA样品,主要是DNA提取,提取的DNA可TE缓冲液溶解后-20度保存;对于RNA样品,抽提RNA后要迅速反转录,将RNA反转录为cDNA,TE缓冲液溶解后可-20度保存。DNA或cDNA样品也不要长期存放,因为在存放过程中会有少量的DNA降解,从而 影响样品中目的基因的含量。对于大量的样品最佳的检测方案是:

    根据实际情况安排好每天要提取的样品数量,提取后若是RAN立即进行反转录反应,并且将当天反转录的样品进行定量PCR检测;千万不可先将所有的样品都提取RNA,提取完RNA后再统一反转录,然后在对cDNA样品进行定量检测,千万不要这样做,因为RNA是极不稳定的,哪怕是存放于-80度冰箱,一方面RNA极其容易降解从而影响检测的准确性,另一方面万一实验室的超低温冰箱放生故障造成停机或停电,那所有提取的RNA将会很大程度的降解,对样品造成不可挽回的损失!

    最好的安排是:当天提取或反转录的样品,当天就进行定量PCR的检测,最大程度的减少RNA的降解,这样测定的结果才更准确。

    2、定量PCR引物及探针的合成

    定量PCR引物及探针的合成

    定量PCR所扩增的片段长度一般都不超过300bp,这样才能确保结果更准确;染料法对引物的特异性要求较高,探针法对引物的特异性要求不高,探针法所扩增的片段长度更短,一般都在200bp以下。引物和探针都要进行Blast分析,以避免非特异性扩增。

    3、标准品的制备---质粒或纯化后的PCR产物

    这一步骤一般在预实验时完成,严格意义上的操作要求将PCR产物切胶后进行胶回收,并进行质粒的连接、转化到感受态大肠杆菌中,质粒在大肠杆菌中增值后提取质粒,并用分光光度计测定含有PCR产物的质粒的OD值,借此来确定质粒的摩尔量,将已知摩尔量的质粒做5倍或10倍的连续梯度稀释,做成质粒标准品,这是准确测定样品中目的基因模板量的定量基础。

    现在也有的不做质粒,直接测定纯化后的PCR产物的摩尔量,然后梯度稀释PCR产物,以此来作为标准品。一般做四个标准品左右5-25-125-625-3125,10-100-1000-10000-100000

    4、通道的选择及增益的选择

    对于任何一款荧光定量PCR仪来说,都有一组或几组激发光和滤光片以及相应的检测器和滤光片,这些就构成了定量PCR仪的通道。不同的发光基团都有相应的激发光和相应的检测器。定量PCR仪从最初的单通道发展到现在的多通道,常用的通道有FAM/HEX/JOE等。可根据自己所用的发光基团来选择相应的通道。

    增益(gain),是荧光信号的放大倍数,发光基团的荧光是很微弱的,必须经过适量的信号放大才能被检测,否则,整个扩增曲线的荧光强度非常小,以致无法准确检测。所以在实验前,要选择合适的增益倍数。

    5、标准曲线的建立

    标准曲线的建立

    梯度稀释后,标准品的扩增曲线间距相等,标准曲线上的间距也相等,说明标准曲线建立的很成功,假如间距参差不齐,说明梯度稀释时操作误差太大,建议重新做标准品的梯度稀释,重新做标准曲线,直到扩增曲线之间的间距相等为止。因为这一步直接影响着样品中目的基因原始模板量的准确性。

    6、加样时的操作

    加样时的操作

    所有的加样操作要围绕着尽量使反应体系均一化为目的,除了样品外,其他试剂都要进行预混,预混后分装到各个PCR管中,最后加样品,移液器要尽量准确,因为这一步的操作可以说是差之毫厘,谬以千里。

    7、阈值的设定

    定量PCR反应结束时开始对结果进行分析,此时需要划定阈值,也就是在扩增曲线的指数期划一条直线,这条线就叫阈值线,在阈值线上,所有的样品的荧光值都一致相同,不同的只是所对应的CT值和初始模板量!
    荧光定量PCR仪阈值的设定

    阈值的设定要尽量让回归系数最大!

    8.熔解曲线分析

    熔解曲线(melt分析)是指定量PCR反应结束后让样品继续升温直到PCR产物的双链全部打开,这时由于双链打开,荧光染料不发荧光,这样荧光值会有一个陡然的突降,借以检测PCR产物的特异性,相当于进行电泳检测。因为不同的PCR产物片段其TM值不同,单一的双链DNA其荧光陡降的温度一致,加入含有非特异性扩增产物,那么其荧光陡降的温度不止一个(两个或更多或杂乱无章)。如图:
熔解曲线分析

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